目的

シスプラチン（CDDP）は、がん治療において最も活性の高い細胞毒性薬剤の一つであり、腎毒性や肝毒性などの有害な副作用を有している。本研究は、腎臓と肝臓のCDDP損傷によって引き起こされる酸化ストレスに対するローヤルゼリー（RJ）の効果を、組織の生化学的パラメータと抗酸化パラメータの測定および免疫組織化学的な調査によって明らかにすることを目的とした。

方法

24匹のSprague Dawleyラットを4群に分けた。

• C群：対照群には0.9%食塩水を投与
• CDDP群：シスプラチン（CDDP、7 mg/kg体重）を単回腹腔内投与
• RJ群：RJ（300 mg/kg/日）を連続15日間経口投与
• RJ + CDDP群：CDDP単回投与後RJを連続15日間経口投与

試験後の動物から採取した血漿、肝臓及び腎臓サンプルを用いて、脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒド（MDA）、グルタチオン（GSH）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）活性、クレアチニン濃度を測定した。肝臓と腎臓の組織学的検査には、Crossmanによって修正されたMalloryの3重染色で染色し、光学顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞は、茶色として見られる免疫組織化学的方法（一次抗体：モノクローナルカスパーゼ-3（アポトーシス細胞を染色）およびBcl-xL（抗アポトーシスを染色），ビオチン化二次抗体）を使用した。抗体の結合部位はDAB（Sigma）で可視化し、高倍率の光学顕微鏡検査（Nikon i50）により評価した。すべてのアポトーシスおよび抗アポトーシス染色細胞は，画像処理システム（Kameram SLR, 1.6.1.0, Mikro Sistem Ltd. Sti，トルコ）を用いて推定した。

結果

RJは、MDAレベルを低下させ、GSHレベルを上昇させ、GST、GSH-PxおよびSOD活性を上昇させることにより、肝臓および腎臓に対して有意な保護作用を示した。 免疫組織化学的検査では、CDDPによるアポトーシス細胞数の有意な増加および変性変化が観察されたが、RJ＋CDDP群の肝臓および腎臓組織ではこれらの組織学的変化は少なかった。さらに、RJの投与は、肝細胞および尿細管上皮の抗アポトーシス活性の上昇を導いた。

結論

CDDP投与は、血清生化学項目の上昇、抗酸化活性の低下、カスパーゼ3免疫染色細胞数の増加で示されるように、肝臓と腎臓に傷害を誘発する。 フリーラジカルの過剰産生は、上記の変化の主な理由の一つである。しかし、RJによる前処理は、CDDPによる肝臓と腎臓の化学変化とアポトーシス細胞数を減少させることがわかった。この保護作用は、ローヤルゼリーとその成分の抗アポトーシス作用、抗酸化作用、フリーラジカル消去作用によるものであると思われる。したがって、RJはCDDP化学療法によって発現する肝臓および腎臓の毒性を予防するのに役立つと考えられる。

表1　CDDPで治療したラットの特定の生化学的パラメータに対するローヤルゼリーの効果

同じ行の異なる上付き文字a, b, cは、グループ間の有意差を示す（n = 6）。
P < 0.05, 平均 ± S.E.M. C: 対照, RJ: ローヤルゼリー, CDDP: シスプラチン

(補足説明：表1)
血清AST及びALTのレベルの上昇は、これらが通常細胞質に位置し、肝障害後に循環中に放出されるため、肝の構造的完全性の損傷に起因するとされています。RJの前処理は、血清ASTおよびALTの活性の低下によって証明されるように、CDDPによる肝障害を顕著に抑制しました。

表2　CDDP投与ラットの肝臓および腎臓におけるMDA、GSH、GSH-Px、GSTおよびSOD濃度に対するローヤルゼリー投与の効果

同じ列の異なる上付き文字a, b, cは、群間の有意差を示す（n = 6）。
P < 0.05, 平均 ± S.E.M. C: 対照, RJ: ローヤルゼリー, CDDP: シスプラチン

（補足説明：表2）
過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素種（ROS）は、通常の細胞状態で発生し、主要なスカベンジャー酵素（GSH-Px、GST、SOD、CATなどのグルタチオン系酵素）によって直ちに無毒化されます。CDDPは、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカル、一重項酸素などのフリーラジカルを放出することによりがん細胞に作用するが、同時に肝臓や腎臓の細胞を損傷します。フリーラジカルは、細胞膜の高度不飽和脂肪酸を攻撃して過酸化脂質を誘発することが知られており、これは多くの病的事象における重要な過程と考えられており、酸化ストレスによって誘発される反応の一つです。CDDPによる過剰な活性酸素の生成は，抗酸化のアンバランスを引き起こし、脂質の過酸化と抗酸化物質の枯渇につながります。CDDP投与ラットの肝臓と腎臓では主要なスカベンジャー酵素活性（GSH、GSH-Px、GST、SOD）が有意に低下していることが確認されましたが、RJで処理すると、フリーラジカル生成によるCDDP誘発の肝臓と腎臓の損傷が改善されました。これらの結果は、RJがGSH、GSH-Px、GST、SOD活性を増加させ、抗酸化システムのサポート効果を持つことを示唆するものです。

表3　肝臓および腎臓におけるカスパーゼ-3およびBcl-xL反応性の半定量的解析

Caspase-3およびBcl-xLの反応密度は以下のように見積もった。
なし：0、弱い：+、中程度：＋＋、強い：＋＋＋、非常に強い：++++. C：コントロール、RJ：ローヤルゼリー，CDDP：シスプラチン

（補足説明：表3）
肝臓および腎臓におけるアポトーシスおよび抗アポトーシス免疫陽性反応を、それぞれカスパーゼ-3抗体およびBcl-xL抗体を用いて検討した。CDDP投与群では、肝臓および腎臓でアポトーシス細胞数が他の群と比較して増加したが、RJ＋CDDP投与群では、アポトーシス細胞数が有意に減少した（P < 0.05,表3）。

図1　ラット肝臓のカスパーゼ3陽性反応。
（a）コントロール、（b）RJ、（c）CDDP、（d）RJ＋CDDP（ストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ染色）、バーは 20 μm。

図3　ラット肝臓のBcl-xL陽性反応。
（a）コントロール、（b）RJ、（c）CDDP、（d）RJ＋CDDP（ストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ染色）、バー20μm。

（補足説明：図１および図３）
対照群及びRJ単独群の肝臓は、正常な組織構造を示した。CCDP投与群では、肝臓組織において、うっ血、拡張、上皮空胞化及び単核細胞の浸潤からなる顕著な組織学的変化が起こった。一方、RJ＋CCDP投与動物では、これらの変化は減少した。 肝臓におけるアポトーシスおよび抗アポトーシス免疫陽性反応を、それぞれカスパーゼ-3抗体およびBcl-xL抗体を用いて検討した結果、CDDP群では肝臓の中心静脈周辺（図1c）にカスパーゼ-3免疫反応細胞が激しく観察された。RJ＋CDDP投与群では、アポトーシス細胞数が減少しています（図1d）。Bcl-xL免疫反応濃度は、CCDP群（図3c）と比較して、肝臓の中心静脈周辺（図3d）で観察された。一方、RJ群では対照群（図3a）に比べBcl-xL陽性反応が増加しました（図3b）。

クレジットライン

[Ali Karadeniz et, al. Royal jelly modulates oxidative stress and apoptosis in liver and kidneys of rats treated with cisplatin. Oxid Med Cell Longev. （2011） 2011 981793, （https://www.hindawi.com/journals/omcl/2011/981793/）© 2011 Ali Karadeniz et, al.; Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).]